中文题目：副干酪乳杆菌S-NB胞外多糖生物合成所需基因对细胞表面特征和益生菌特性的影响

发表期刊：International Journal of Biological Macromolecules（IF: 8.025）

发表时间：2022.10

发表单位：南京农业大学食品科学技术学院

研究背景

乳业和功能性食品中添加乳酸菌（LAB）作为益生菌补充剂有助于调节肠道菌群的平衡。LAB的有益作用被怀疑与细胞表面成分有关，其中，胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)是来源于LAB的细胞外生物聚合物，被广泛应用于各种乳制品中。EPS还可能具有抗氧化活性、免疫调节活性和多种有益的健康作用。LAB成员副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)被认为是广泛从传统发酵酸奶中分离出来的主要微生物之一，具有促进健康的特性。近年来，越来越多的证据表明副干酪乳杆菌可能具有平衡肠道菌群、免疫调节、预防致病性感染和高脂血症的作用。然而，副干酪乳杆菌维持生态位并在寄主体内提供这些积极作用的分子机制仍不清楚。

本研究对副干酪乳杆菌S-NB中的EPS进行了初步分离和表征，并对EPS基因簇进行了预测和分析，旨在鉴定EPS生物合成的相关基因，并通过突变分析证明其在表型特征和益生菌功能中的作用。贝纳基因提供了该研究中的细菌基因组测序和分析服务。

材料与方法

1. 细菌菌株培养和DNA提取

2. 副干酪乳杆菌S-NB的分子鉴定及全基因组测序

★使用Illumina NovaSeq和Nanopore PromethION平台测序

3. EPS的分离纯化

4. 逆转录PCR和实时定量PCR分析

5. 基因缺失突变体菌株的构建

6. 透射电子显微镜观察

7. 生物膜形成指标、自聚集、疏水性和zeta电位分析

8. 体外Caco-2粘附试验、体外胃肠道存活试验和免疫调节活性测定

主要研究结果

1. L. paracasei S-NB的分子鉴定及基因组特征

16S rRNA基因序列测序后，与已知菌株进行比对，系统发育分析结果证实S-NB为副干酪乳杆菌(图1B和C)。S-NB的基因组全长为3152144 bp，由一条环状染色体(3103392 bp, GC含量为46.38%)和一个质粒组成(图1D)。S-NB全基因组共包含3104个基因，其中蛋白编码基因(CDS) 3010个，tRNA基因59个。将1543个编码基因划分为KEGG功能类，说明副干酪乳杆菌S-NB具有多种代谢途径，能够适应环境条件。

图1 S-NB菌株形态和基因组特征

2. EPS生物合成相关基因的鉴定

在L. paracasei S-NB基因组中鉴定出一个约21.8 kb的具有特异性注释信息的EPS基因簇。基于NCBI注释和BLASTp分析，共鉴定出19个QRFs。其中，EPS基因簇中的4个假定基因(S-NB_2176、S-NB_2175、S-NB_2174和S-NB_2173)因其在EPS生物合成中的不同功能而被选择进行进一步研究。利用NCBI ORF-finder预测EPS基因簇可能的启动子序列和编码区域。序列分析表明S-NB的EPS基因簇由两个多顺反子单元组成，分别由15个orf和2个ORF组成。多重RT-PCR扩增如图2A所示，表明第一个启动子单独负责EPS基因簇上游前15个基因的调控转录。而S-NB_2162和S-NB_2161分别由一个单独的启动子转录。

图2 副干酪乳杆菌S-NB EPS簇基因间区表达分析

3. 独特EPS基因的缺失影响菌株的表型

构建了四个功能不同的关键基因(S-NB_2176、S-NB_2175、S-NB_2174和S-NB_2173)的缺失突变体(图2B)。相应的基因在特定突变株中未表达，与野生型S-NB相比，突变株中第一共转录单位的15个基因的表达均显著降低。透射电镜(图3A-E)和细胞壁厚度测量(图3F)都表明，突变菌株在细胞周围产生的EPS比野生型S-NB少。4个突变体衍生物的细胞壁均比S-NB更薄，特别是S-NBΔ2176和SNBΔ2175，表明S-NB中S-NB_2176(负责EPS聚合)和S-NB_2175(负责CpsD/CapB家族酪氨酸蛋白激酶)与EPS的积累密切相关。

图3副干酪乳杆菌S-NB与4株突变株的细胞壁厚度

4. 生物膜的形成

EPS在生物膜的形成中发挥重要作用，促进细胞表面的初始定殖和生物膜的长期粘附。染色实验显示，S-NBΔ2176和S-NBΔ2175菌株的生物膜形成总量均较野生型菌株显著降低(图4A)。然而，S-NBΔ2173在生物膜形成能力与野生型S-NB相似，说明2173基因的缺失可能对生物膜的形成没有影响。另外，研究了EPS基因在影响细菌与环境相互作用的表面理化性质方面的作用。突变株的疏水性较弱，S-NB与4个突变株之间存在显著差异。不同孵化时间的自聚力检测结果说明EPS基因突变株在短时间内的自聚集能力要低于野生型。

图4 S-NB和突变株的BFI、细胞表面疏水性、自聚集和电位分析

5. 菌株的黏附能力与免疫调节能力

利用人肠细胞株Caco-2在体外研究野生型S-NB和突变株的粘附能力(图5A)。副干酪乳杆菌S-NB的4株突变株中，S-NBΔ2176对肠细胞的粘附最弱。野生型S-NB比这些突变株对Caco-2细胞有更好的粘附性，可能是由于S-NB细胞表面存在EPS层。为了评估EPS生物合成是否影响S-NB菌株在胃肠道条件下的生存，进行了体外胃肠道生存试验(图5B)。比较分析表明，各菌株间差异显著。

图5 S-NB及其突变株体外胃肠试验时对Caco-2细胞的粘附和相对存活能力

LAB的主要免疫益处是通过与胃肠道粘膜相互作用调节宿主的免疫反应。为了研究野生型S-NB和突变株对炎症因子产生的影响，分别用LPS（革兰氏阴性菌的细胞壁成分）和菌株处理RAW264.7细胞株。如图6D所示，S-NB和突变株处理后，促炎因子TNF-α的表达水平在一定程度上降低，尤其是S-NBΔ2175和S-NBΔ2176。相反，抗炎IL-10细胞因子的表达水平相对较高。此外，与LPS刺激相比，益生菌诱导能够显著使促炎IL-1β 的mRNA水平下降。结果表明，添加益生菌可以调节炎症反应。然而，并非所有突变株的炎症因子表达水平都与野生型S-NB有显著差异。这一结果可能与培养时间短和菌株依赖性有关。

图6 野生型S-NB和突变株对体外RAW264.7细胞的影响以及TNF-α、IL-10和IL-1β细胞因子的表达

研究结论

在L. paracasei S-NB中，敲除参与EPS生物合成的基因改变了其表面形态和理化性质。TEM分析表明，S-NBΔ2176和S-NBΔ2175的细胞壁厚度较野生型S-NB薄。同时，两种突变体的生物膜形成减少，表面亲水性增强，自聚集减少，表面负电荷降低。此外，EPS合成相关基因的缺失可能会对副干酪乳杆菌S-NB对宿主细胞(Caco-2)的粘附产生负面影响，但这些基因的存在并不有助于在模拟胃肠道环境下的生存。上述结果有力地说明了EPS对副干酪乳杆菌S-NB细胞表面特征和细胞-宿主相互作用的影响是不可预测的和多样化的。

参考文献

Xiao L, et al. Effects of genes required for exopolysaccharides biosynthesis in Lacticaseibacillus paracasei S-NB on cell surface characteristics and probiotic properties. International Journal of Biological Macromolecules, (2023).